ハイパープラスキット (for illumina)

8割以上のサンプルで十分量のデータを得ることができました。
少量のスケールでもライブラリを調製することができた点がよかったです。
粗精製のゲノムからも調製できると大変助かります。

NGSライブラリのためのDNA断片化において、物理的な断片化方法も考えましたが、元のDNAの量やサイズがバラバラだと、この方法では常に同じサイズに揃えるのは難しい。
酵素を用いた容易な断片化法を求めていたところ、KAPA Frag Kitがあったので早速試しました。
元のDNAの長さが数キロだろうがゲノムだろうがほぼおなじ条件でよいようなので、条件検討は反応時間の確認だけで済みました。
あまりにも簡単に、均一なDNA断片化ができたので感動しました。

腸内細菌叢解析の実験の始めるときにDNAの断片化用の機器が手元になかったため、酵素で断片化処理が可能なKAPA HyperPlus Kitを選択しました。
KAPA HyperPlus Kitは、サーマルサイクラー上で多検体のライブラリーを同時に調製でき、8連チューブまたは96穴PCRプレート対応のマグネットを使用することにより、効率的なライブラリー調製を行うことができました。
また、以前に、他社断片化酵素を用いてライブラリを作製した際には、読み始めの配列に偏りが生じ、十分な解析結果が得られませんでしたが、KAPA HyperPlus Kitを用いることにより、解析に十分な結果を得ることができました。

濃度がまちまちな96本のDNAサンプルからそれぞれ同じDNA量を採るためにExcelで液量を計算していた時に、このデータをそのままQIAgilityに読み込ませれば自動化できると気づいたことがきっかけです。
DNA量がそろってしまえばあとは試薬を加え、シールしてサーマルサイクラーにかける作業を繰り返すだけなので簡単です。
多サンプルでは時間と労力を大幅に低減できるのでもちろんですが、サンプルが少ない場合でも安定性と再現性の良さからQIAgilityを使用するようになりました。
これまでのライブラリ作成では、DNA断片化をPCRチューブで行うことができないため、酵素反応でチューブフォーマットを変更する必要があったのに対し、KAPAHyperPlusキットは断片化からライゲーションまでone-tubeで行えるように設計されているため、自動化への親和性が高いことが特徴です。このため、今回ライブラリ作成の自動化が実現したのはKAPAHyperPlusKitの存在に依るところが大きいです。

KAPA HyperPlus kitはヒトの多くの疾患を対象とした全ゲノム解析あるいはエキソーム解析で、最も頻繁に用いられているライブラリ調製キットである。
今回のシングルセルエキソーム解析にも、微量からのライブラリ調製、という点で非常に優秀な性能を明らかにしたと考えている。

KAPA HyperPlusは酵素処理による断片化をベースとしてシンプルなワークフローで構成されているので、特殊なDNA断片化装置や自動液体分注機や核酸精製機を研究室に導入することなく、簡単に実験に取り入れることができました。
本製品は、反応条件をアレンジした際にも安定したデータを産出してくれるので、反応液量を節約することでお財布に(比較的)優しいシーケンスライブラリ調製が可能です。また、ライブラリ作製に不慣れな初心者が導入する際にも本製品はオススメできると思います。

1. TapeStationでの可視化が困難なため多めの量でこの試験は行っているが、SMART-Seq v4でのライブラリ調整や1ngからのサンプル調整からもわかるように、微量な初発量からでも安定してライブラリが作成できた。
2. DNAのGC含量や配列の特徴によって切断時間はある程度変動があるが、基本的に同じDNAを使えば時間に比例して任意の長さの断片が得られた。ただし、Covarisの方が目的断片の量はやや多く得られる印象。個人的にはゲノムなど長さがCriticalな場合にはCovarisが第一選択肢になる。一方、RNA-Seq（定量目的）の場合は長さは一定以上あれば特に問題なく、非常に多検体を扱うため、そういった場合にはHyperPlusが明らかに第一選択肢になる。
3. 酵素法のため、サンプルを並列処理でき、Covarisに比べて圧倒的に作業が楽で効率が良い。
4. 他社のKitはアダプターライゲーション反応が10μl程度などの少量で行うものが多いが、KAPAはFragmentationの段階から50μlで、反応系縮小の余地がある。これは微量サンプルを扱う時に非常に有利(1/5反応系だと実質濃度を5倍あげられる)であり、大変経済的である。
5. ある程度収量を得る事を考えると、最後のPCR増幅だけは1/5までは反応系を下げられない。しかし、この段階はPCR用Illuminaアダプターに対応した自作オリゴとKAPA HiFi HS Ready Mixを使うことで安く増幅ができることを確認（他社酵素ではうまくいかなかった）
Primer-1 AATGATACGGCGACCACCGAGA
Primer-2 CAAGCAGAAGACGGCATACGAG OPC精製 (Eurofins)

KAPA HyperPlus Kitはライブラリ作成効率が非常に良く、わずかなDNA量であっても全ゲノムシーケンスが可能であるため、近縁種間で転用可能なSSRマーカーを迅速かつ大量に開発する上で非常に有効な手段であることを実感しました。

KAPA HyperPlus Kit は、ライブラリ作製効率が非常に良いので、今まで DNA 量に限りがあってシーケンスが不可能だったサンプルでも PCR-free のライブラリ作製が可能になりました。
量に限りがあるサンプルのシーケンスに、とても有効だと感じました。
これまで PCR-free のゲノムショットガンライブラリ（de novo ゲノム解析）を作製するには μg スケールのDNA が必要でしたが、KAPA HyperPlus Kit では 数百 ng の DNA があれば十分になり、必要量が従来の1/5-1/10量位になった ということを強く実感しました。
また、断片化装置が不要であり、ライブラリ調製過程の精製が最小限で済むので、ロボットを使用したライブラリ作製にも取り入れやすいです。