KAPA Hyper Prep Kit / 96反応分

本製品は1ngの鋳型より作製が可能という点と、試薬構成がシンプルなため簡便に反応を進めることができる点が魅力である。
そのため多検体を処理する際にも抵抗なく作製が可能である。
今回のケースでは微量の鋳型からシーケンスを行うための十分なライブラリー量を作製でき、de novo assembly に必要量の高品質データを得ることができた。

臨床データの豊富さや希少疾患(腫瘍)への解析のため、FFPEサンプルのNGS解析が、今後、求められています。
また、臨床シークエンスへの展開を考えた場合、過去の生検標本など微量なFFPE 標本からのDNAに対するNGS解析に適した方法の確立が必要になります。
FFPE 標本からのDNAは、PCR duplicationが非常に多く（時には50％以上）、データの質も悪いから、、、と敬遠しておりましたが、KAPA Hyper Prep Kit のライブラリー構築の効率の良さは、驚くべきものでした。
KAPA Hyper Prep Kit は、FFPEを用いての臨床シークエンスの手法に大きなインパクトをあたえることは間違いありません。
特に、臨床シークエンスを考えた場合、生検のFFPEしか癌組織がないような状況が多々あり、KAPA Hyper Prep Kit だと、
生検のFFPEの数スライスからのDNA（50-100ng程度）でも効率よくNGSライブラリーの構築ができる可能性があるので、非常に有望です。

がんゲノム解析に主に用いられる凍結組織サンプルの場合と異なり、血漿サンプルから得られるcfDNAは通常数十ngと微量であり、さらに高度に断片化されているため、最低でも200 ngの質の良いDNAを必要とするSureSelect Target Capture systemによるターゲットシークエンスを行なうことはこれまで極めて困難でした。KAPA Hyper Prep Kitを用いることにより、断片化されたcfDNAからも効率よくライブラリを構築することができ、少ないinput量でも10サイクル以下のPCRでキャプチャに十分な量のライブラリが得られたことには驚きました。今 回 のSureSelectカスタムパネルの ようにターゲット遺伝子を限定することで低コストでdeep sequencingを行なうことも可能であり（今回の検討では平均で1000x以上）、cfDNA中に低頻度に存在するがん由来DNAの変異も検出することができると考えられます。

非常に低濃度かつ状態の悪いDNAからもライブラリーを作成することができたため、エインシェントDNAのライブラリー作成にも有効ではないかと考えられる。
Covarisを使ったため、断片化したDNAのロスが大きいため、ここを解決する必要があると思われた。

KAPA Hyper Prep Kitは精製ステップが少なく、時間と手間が省け、簡便であった。
また、ライブラリー増幅用酵素KAPA HiFi HotStart ReadyMixは、増幅バイアスが抑えられるため、もともとライブラリーの増幅用に使用していたが、今回得られたデータでもバイアスが 低く抑えられていた。
また増幅効率が良いためライブラリー増幅の際のサイクル数をさらに減らすこともできる。
今後、より少ない試料からのライブラリー作成が行えることを期待している。

KAPA社の前キットも酵素の安定性など優れた点が多かったですが、精製工程が多く、one-tubeで反応が完了するキットが一部他の会社から売りだされるなど、もっと単純化されることが望まれていました。
KAPA Hyper Prep kitは、工程の単純化と精度の担保と向上を同時に達成した良いキットだと思います。
KAPA社は、安全マージンを多めにとってプロトコルを出しているため、1ng以下の微量におけるデータがありませんでしたが、我々が確かめたところ微量領域においても高いライブラリー変換効率を保つことが確かめられました。
最適化プロトコルは我々のラボWebサイトからダウンロードできます。少ない工程で、液を上から足していけば達成できるので、大多数のユーザーにとってファーストチョイスになると思いました。