過剰増幅はどのような影響をもたらしますか？

過剰増幅はライブラリー増幅中にプライマーが枯渇した結果、一本鎖の増幅産物が形成されます。

これらの産物は断片の両端にあるアダプターの相同性を介して互いにアニールしてヘテロ二本鎖を形成するため、電気泳動ベースのフラグメント分析では実際の塩基対の長さよりも大きな産物として測定されます。

これらのヘテロ二本鎖は一本鎖DNA部分を多く含むため、過剰増幅により dsDNA 結合色素を用いたアッセイではライブラリー分子の定量が不十分となります。

しかしながら、KAPA ライブラリー定量アッセイのような qPCR ベースのライブラリー定量法は、変性と増幅によって DNA を定量するため、ライブラリーが過剰増幅された場合でも、アダプターが付加されたライブラリー量を正確に測定することができます。

このアーチファクトはプライマー濃度を高くしたり、PCR サイクル数を減らしたりすることで解決しますが、一本鎖の増幅産物はシーケンスキャプチャーやシーケンスに使用しても問題ありません。

【最終更新日：2024年10月18日】